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一种液质联用测定人血浆中羟丙基
β
环糊精含量的分析方法
技术领域
1.本发明属于g01n30/02技术领域，更具体的涉及一种液质联用测定人血浆中羟丙基β环糊精含量的分析方法。
背景技术：
2.羟丙基β环糊精易溶于水，且具有优异的包合作用，在医药领域可以作为静脉输送药物的增溶剂、促流动剂、药物稳定剂、靶向给药剂等，得到了广泛的研究。现有技术中，对于药物中羟丙基β环糊精的含量已有研究。
3.例如中国专利cn113671061a中公开了测定丁苯酞氯化钠注射液中羟丙基被他环糊精含量的方法，采用液相色谱法进行检测，检测过程简单、快速，检测结果准确可靠。中国专利cn101685083b中公开了一种液质联用测定羟丙基β环糊精的测试方法，可以用来检测冻干型多西他赛制剂或尿液中的羟丙基β环糊精的含量。
4.然而，羟丙基β环糊精在血液中需要通过肾脏的代谢作用排出体外，长期且大量的羟丙基β环糊精积累在血液中可能会导致溶血等现象的发生，对人体产生危害。而现有文献中对于血浆中或血液中羟丙基β环糊精的含量的分析研究和报道较少。本技术基于此，提出了一种液质联用测定人血浆中羟丙基β环糊精含量的分析方法。
技术实现要素：
5.本发明提出了一种液质联用测定人血浆中羟丙基β环糊精含量的分析方法，包括以下步骤：
6.(1)制备羟丙基β环糊精工作溶液；
7.(2)样品前处理；
8.(3)采用液相色谱-质谱联用方法进行检测；
9.所述样品为空白血浆。
10.在一种优选的实施方式中，所述空白血浆是抗凝剂为k2edta的空白人血浆。在本技术中，人血浆采集于身体健康的志愿者，志愿者为年龄18岁及以上的健康志愿者，男女不限；男性健康志愿者体重不低于50公斤或女性健康志愿者体重不低于45公斤，体重指数(bmi)：≧19kg/m2且≤30kg/m2；健康志愿者(包括男性健康志愿者)愿意未来2个月内无妊娠计划且自愿采取有效避孕措施；健康志愿者自愿参加试验，并签署了书面的知情同意书。
11.在一种优选的实施方式中，所述步骤(1)中工作溶液包括羟丙基β环糊精储备溶液、内标物储备溶液、标准曲线工作溶液、质控样品工作溶液、内标物工作溶液、标准曲线样品溶液、质控样品溶液、定量限样品溶液、沉淀剂。
12.在一种优选的实施方式中，所述内标物储备溶液为酸枣仁皂苷b储备溶液。
13.在一种优选的实施方式中，所述羟丙基β环糊精储备溶液、内标物储备溶液、标准曲线工作溶液、质控样品工作溶液、内标物工作溶液均用超纯水稀释配置。
14.在一种优选的实施方式中，所述质控样品工作溶液用来检测包括萃取回收率、基
质效应、基质稳定性、准确度、精密度。
15.在本技术中，质控样品工作溶液根据工作溶液中质控样品的浓度，分成低浓度质控样品工作溶液、中浓度质控样品工作溶液、高浓度质控样品工作溶液，所述低浓度质控样品工作溶液、中浓度质控样品工作溶液、高浓度质控样品工作溶液中质控样品浓度的比值为3:25:40。
16.在一种优选的实施方式中，所述质控样品工作溶液还用来检测溶液稳定性、溶血效应、高脂血效应、全血稳定性。
17.在本技术中，检测的是人血液中或者是人血浆中羟丙基β环糊精的含量，而血液中的红细胞、存在的胆固醇、微量元素、蛋白质等物质在血液采集及进行检测分析的过程中会对分析结果造成影响。
18.在一种优选的实施方式中，所述标准曲线样品溶液由空白血浆和标准曲线工作溶液混匀形成，所述标准曲线样品溶液中空白血浆和标准曲线工作溶液的体积比为19:1。
19.在一种优选的实施方式中，所述样品前处理的具体方法如下：
20.s01取96孔板加入样品，再加入内标工作溶液和沉淀剂，振荡；
21.s02 4℃下离心，将离心后的上清液取出，加入新的96孔板中；
22.s03氮气吹干，加入体积浓度20％的甲醇水溶液复溶，振荡；
23.s04上机检测。
24.在一种优选的实施方式中，所述样品为标准曲线样品溶液，所述沉淀剂为甲醇。
25.申请人在实验过程中发现，先把空白血浆、羟丙基-β-环糊精的标准曲线工作液等溶液混合均匀后，再进行样品的前处理，可以降低前处理过程中待测物质(羟丙基-β-环糊精)的损失，降低血浆样品中羟丙基-β-环糊精含量的检测下限，提高最终检测结果的灵敏度、准确度。申请人推测可能的原因是，羟丙基-β-环糊精作为包合材料，容易与血浆中的物质如蛋白质等结合或包合，在经过蛋白沉淀的前处理过程中，会降低血浆中原有羟丙基-β-环糊精的含量，造成最终羟丙基-β-环糊精检测含量的降低，影响检测结果的灵敏度、准确度；而若先在前处理之前，在空白血浆中加入羟丙基-β-环糊精的标准曲线工作液等溶液，再进行样品的前处理，可以避免空白血浆因自身的蛋白沉淀造成的羟丙基-β-环糊精实际检测结果过低的现象，降低血浆样品中羟丙基-β-环糊精含量的检测下限，避免出现样品中检测不出羟丙基-β-环糊精的现象，提高检测结果的灵敏度、准确度。
26.在一种优选的实施方式中，所述沉淀剂的加入量与样品的加入量的体积比为(15-20)：1。
27.在一种优选的实施方式中，所述液相色谱的色谱条件如下：流动相a选自甲酸纯水溶液、乙腈纯水溶液、乙酸纯水溶液、纯化水中的至少一种；流动相b选自甲酸-甲醇溶液、甲醇纯水溶液、甲醇溶液、纯化水中的至少一种。
28.在一种优选的实施方式中，所述流动相a为甲酸纯水溶液，甲酸纯水溶液中甲酸含量为0.1％(v/v)；所述流动相b为甲酸-甲醇溶液，甲酸-甲醇溶液中甲酸含量为0.1％(v/v)。
29.在一种优选的实施方式中，所述液相色谱的洗脱条件如下：
30.0.00min，流量0.3ml/min，流动相a与流动相b的体积比19:1；
31.0.60min，流量0.3ml/min，流动相a与流动相b的体积比19:1；
32.0.61min，流量0.3ml/min，流动相a与流动相b的体积比1:4；
33.2.00min，流量0.3ml/min，流动相a与流动相b的体积比1:4；
34.2.01min，流量0.4ml/min，流动相a与流动相b的体积比19:1；
35.4.00min，流量0.3ml/min，流动相a与流动相b的体积比19:1。
36.申请人在实验过程中发现，选用甲酸纯水溶液和甲酸-甲醇溶液作为流动相，并且通过控制洗脱条件，提高羟丙基β环糊精的分离度，提高基线稳定性，提高检测准确度和灵敏度。
37.在一种优选的实施方式中，所述液相色谱的工作参数如下：色谱柱为waters beh c18，2.1
×
50mm，1.7μm；柱温50℃；自动进样器温度4℃；进样体积1μl。
38.在一种优选的实施方式中，所述质谱的工作条件如下：采用多反映检测方式进行正离子检测；离子源温度500℃；离子源喷雾电压5000v；监测离子对：羟丙基β环糊精为m/z321.3/240.1，酸枣仁皂苷b为m/z1067.6/935.5；去簇电压：羟丙基β环糊精为220-250v，酸枣仁皂苷b为60v。
39.与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
40.1.本发明提出的检测人血浆中羟丙基β环糊精的分析方法，在前处理过程中，采用蛋白沉淀法，缩短样品处理时间，降低样品处理成分。并且在前处理过程中，先配置出样品溶液(羟丙基-β-环糊精)，再用甲醇作为沉淀剂去除样品中的蛋白，降低前处理过程中待测物质(羟丙基-β-环糊精)的损失，降低血浆样品中羟丙基-β-环糊精含量的检测下限，提高最终检测结果的灵敏度、准确度。
41.2.本发明提出的检测人血浆中羟丙基β环糊精的分析方法，在液相色谱质谱联用过程中采用特定的去簇电压将羟丙基β环糊精打碎成易检测的分子结构碎片，提高了羟丙基β环糊精的检测准确度和精密度。
42.3.本发明提出的检测人血浆中羟丙基β环糊精的分析方法，不受血液自身红细胞溶血效应、高脂血效应、血液选择性的影响，方法适用性广，检测结果准确可靠。
附图说明
43.图1为实施例1中双空白样品色谱图。
44.图2为实施例1中质控样品色谱图。
45.图3为实施例1中10.0μg/ml样品的色谱图。
46.图4为实施例1中羟丙基β环糊精子离子扫描离子谱图。
具体实施方式
47.实施例1
48.本实施例提出了一种液质联用测定人血浆中羟丙基β环糊精含量的分析方法，步骤如下：
49.(1)制备羟丙基β环糊精储备溶液：准确称取(2-羟丙基)-β环糊精加入棕色玻璃瓶中，加入纯化水溶解、摇匀，配制成浓度为100.0mg/ml的(2-羟丙基)-β环糊精储备液。
50.(2)制备内标物储备溶液：准确称取适量酸枣仁皂苷b标准品于棕色玻璃瓶中，准确加入甲醇溶解、摇匀，配制成浓度为5.0mg/ml的酸枣仁皂苷b储备液。
51.(3)制备标准曲线工作溶液：将羟丙基β环糊精储备溶液用纯化水逐级稀释，制备得到，制备得到的标准曲线工作溶液中羟丙基β环糊精的浓度分别为200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1600μg/ml、3200μg/ml、6400μg/ml、9000μg/ml、10000μg/ml。
52.(4)制备质控样品工作溶液：羟丙基β环糊精储备溶液用纯化水逐级稀释，制备得到，制备得到的质控样品工作溶液中羟丙基β环糊精的浓度分别为200μg/ml、600μg/ml、5000μg/ml、8000μg/ml。
53.(5)制备内标物工作溶液：内标物储备溶液用纯化水稀释，制备得到，所述内标物工作溶液中酸枣仁皂苷b的浓度为200μg/ml。
54.(6)制备标准曲线样品溶液：在空白血浆中加入标准曲线工作溶液，配置得到标准曲线样品溶液；所述空白血浆和标准曲线工作溶液的体积比为19:1；所述标准曲线样品溶液中羟丙基β环糊精的浓度分别为10.0μg/ml、20.0μg/ml、40.0μg/ml、80.0μg/ml、160.0μg/ml、320.0μg/ml、450.0μg/ml、500.0μg/ml；标准曲线样品溶液的线性关系良好，y＝196x-766(r2＝0.9906)。
55.(7)制备质控样品溶液：在空白血浆中加入质控样品工作溶液，配置得到质控样品溶液；所述空白血浆和质控样品工作溶液的体积比为19:1；所述质控样品溶液中羟丙基β环糊精的浓度分别为10.0μg/ml、30.0μg/ml、250.0μg/ml、400.0μg/ml；其中低浓度质控样品工作溶液(lqc)中羟丙基β环糊精浓度为30.0μg/ml；中浓度质控样品工作溶液(mqc)中羟丙基β环糊精浓度为250.0μg/ml；高浓度质控样品工作溶液(hqc)中羟丙基β环糊精浓度为400.0μg/ml。
56.(8)制备定量限样品溶液：定量限样品溶液与质控样品溶液配置方式相同，定量限样品溶液中羟丙基β环糊精的浓度10.0μg/ml。
57.(9)样品前处理：
58.s01取96孔板加入20μl待测溶液，再加入20μl内标物工作溶液和360μl甲醇，振荡10min；制备双空白样品：取96孔板加入20μl空白血浆，再加入20μl甲醇，再加入360μl甲醇，振荡10min；
59.s02振荡后的96孔板于4℃下、4000rpm条件下离心10min，将离心后的上清液取出100μl，加入新的96孔板中；
60.s03氮气吹干，加入体积浓度20％的甲醇水溶液200μl复溶，振荡10min；
61.s04上机检测。
62.(10)采用液相色谱-质谱联用方法进行检测。
63.其中液相色谱的工作条件如下：色谱柱为waters beh c18，2.1
×
50mm，1.7μm；柱温50℃；自动进样器温度4℃；进样体积1μl；流动相a为甲酸纯水溶液，甲酸纯水溶液中甲酸含量为0.1％(v/v)；流动相b为甲酸-甲醇溶液，甲酸-甲醇溶液中甲酸含量为0.1％(v/v)；
64.所述液相色谱的洗脱条件如下：
65.0.00min，流量0.3ml/min，流动相a与流动相b的体积比19:1；
66.0.60min，流量0.3ml/min，流动相a与流动相b的体积比19:1；
67.0.61min，流量0.3ml/min，流动相a与流动相b的体积比1:4；
68.2.00min，流量0.3ml/min，流动相a与流动相b的体积比1:4；
69.2.01min，流量0.4ml/min，流动相a与流动相b的体积比19:1；
70.4.00min，流量0.3ml/min，流动相a与流动相b的体积比19:1。
71.其中质谱的工作条件如下：采用多反映检测方式进行正离子检测；离子源温度500℃；离子源喷雾电压5000v；监测离子对：羟丙基β环糊精为m/z321.3/240.1，酸枣仁皂苷b为m/z1067.6/935.5；去簇电压：羟丙基β环糊精为230v，酸枣仁皂苷b为60v。
72.采用液相色谱质谱分析得到羟丙基β环糊精的子离子扫描离子谱图如图4所示。双空白样品色谱图如图1所示。质控样品色谱图如图2所示。10.0μg/ml样品的色谱图如图3所示。
73.性能测试
74.根据实施例提供的分析方法，检测萃取回收率、基质效应、基质稳定性、准确度、精密度、处理后稳定性、溶血效应、高脂血效应、全血稳定性、血浆选择性。数据结果如下所述：
75.1.萃取回收率和基质效应：将lqc、mqc、hqc溶液分别平行检测6次浓度，检测萃取回收率和基质效应。
76.萃取回收率：
[0077][0078]
基质效应：
[0079][0080]
2.基质稳定性：将制备好的lqc和hqc溶液在室温下放置24小时，后，检测3次浓度，数据如下：
[0081][0082][0083]
3.准确度与精密度：
[0084][0085][0086]
4.处理后稳定性：将加入lqc和hqc的样品经过前处理后，在4℃下放置48小时，后，
检测3次浓度，数据如下：
[0087][0088]
5.溶血效应：用溶血后的血浆替代空白血浆，进行加入lqc和hqc的样品检测，检测3次浓度，数据如下：
[0089][0090]
6.高脂血效应：用采集于具有高脂表征的志愿者的血浆替代空白血浆，进行加入lqc和hqc的样品检测，检测3次浓度，数据如下：
[0091][0092][0093]
7.全血稳定性：将从健康的志愿者处采集的全血在室温下放置2小时，后，在4℃、1700g条件下离心10min，得到血浆，进行加入lqc和hqc的样品检测，检测3次浓度，数据如
下：
[0094][0095]
8.血浆选择性：采集6名志愿者空腹血液和餐后血液，分离得到血浆，进行加入lqc和hqc的样品检测，数据如下：
[0096]