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本发明属医药领域，具体涉及一类螺[哌啶-4,5'-[5h]吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'（6'h）-酮-d-酒石酸衍生物类的设计合成及其在抗微生物方面的应用。
背景技术：
近年来，随着医疗水平的不断提升和快速发展，许多顽固疾病得到了有效的治疗，但是由于抗生素的滥用致使微生物抗药性上升，造成患者免疫系统低下；此外，由于市场上流通的多烯类、唑类、烯丙胺类、吗啉类、棘白菌素类以及灰黄霉素类等抗真菌药物自身存在抗菌谱窄、副作用大等缺点，使得真菌感染引起的患者发病率与死亡率逐年上升，已对人类生命健康造成严重威胁。因此探索与合成一种新型、高效，广谱、小副作用的抗菌类药物在国内外医学领域备受关注。
螺环化合物因其两环平面相互垂直的结构、较强的刚性结构、异头效应、螺共轭效应及其螺超共轭效应等特殊结构，使其具备不仅可以提高配体与靶蛋白的亲和性与适应性，同时还可以增加生物代谢稳定性的优势，因此被广泛应用于抗真菌、抗肿瘤、抗病毒、抗焦虑、抗糖尿病、消炎等医学领域。另外研究表明，通过胺与酸缩合形成的酰胺键，作为大量药物分子的药效基团，能有效改善药物活性并降低毒副作用，此外研究也发现含氮杂环结构在抗几丁质合成酶方面表现出较好的活性，这类研究文章可见：j.medchem.2010,53(5):1937-1950；bioorg.med.chem.lett.2011,21(4):1270-1274；bioorg.med.chem.lett.2011,21(6):1593-1597；bioorg.med.chem.2001,9(8):1999-2013。
本发明设计并合成了一类螺[哌啶-4,5'-[5h]吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'（6'h）-酮-d-酒石酸类化合物，以多抗霉素b为对照，测定了该类化合物对几丁质合成酶的抑制作用，并测定了其在抗真菌、抗细菌方面的活性，拓展了此类化合物的应用范围。到目前为止，本发明所涉及的新型化合物在抑制几丁质合成酶活性方面还未见报道，所以可将其作为几丁质合成酶的抑制剂，开发成新型的抗真菌制剂。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种螺[哌啶-4,5'-[5h]吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'（6'h）-酮-d-酒石酸衍生物类；本发明的目的之二在于提供螺[哌啶-4,5'-[5h]吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'（6'h）-酮-d-酒石酸衍生物类的制备方法；本发明的目的之三在于提供所述的螺[哌啶-4,5'-[5h]吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'（6'h）-酮-d-酒石酸衍生物类在制备抗细菌/抗真菌药物中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明所述的螺[哌啶-4,5'-[5h]吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'（6'h）-酮-d-酒石酸衍生物类结构如通式1所示：
其中r1为h，r2为2-ch3o-4-o2nc6h3，4-brc6h4，4-ch3c6h4，2-o2nc6h4，4-hoc6h5，ph，6-ch3oc4h2n2，2-clc6h4，4-o2nc6h4，4-f3cc6h4，3-o2nc6h4，3-brc6h4，3-h3cc6h4，3-h3cc6h4，2-ch3oc6h4，2-h3cc6h4，2-brc6h4，4-clc6h4或3-clc6h4等等，上述物质是分别唯一对应一个结构式的具体化合物，具体地，通式1所示的螺[哌啶-4,5'-[5h]吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'（6'h）-酮-d-酒石酸衍生物类为下述化合物的任意一种：
。
上述螺[哌啶-4,5'-[5h]吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'（6'h）-酮-d-酒石酸衍生物类的合成方法，按如下进行：
如scheme1所示
。
具体地说，上述scheme1反应条件如下：
a.化合物2与化合物3a经edc缩合成，然后酯碱性条件下水解生成化合物4a。溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃等，优选二氯甲烷；化合物2，3a，的摩尔比为1:1.1~2，室温至45℃，反应6-8h；
b.化合物4a再与化合物5，经t3p缩合，最后脱羟基保护生成化合物1a，溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃等，优选二氯甲烷；化合物5:4a摩尔比1:1.1~2，优选二氯甲烷为溶剂，室温至45℃反应8-12h。
本领域普通技术人员均可按上述公开的制备方法制得相应的化合物。
上述螺[哌啶-4,5'-[5h]吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'（6'h）-酮-d-酒石酸衍生物类在制备抗病原微生物药物中的应用。所述微生物为病原细菌或病原真菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、变形杆菌、铜绿色假单胞菌；白色念珠菌、新型隐球菌、黄曲霉菌、烟曲霉菌等。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定，但本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
实施例1、（4s,5s）-2,2-二甲基-5-（苯基氨基甲酰基）-1,3-二氧戊环-4-羧酸（4a）的制备
依次称取保护的d-酒石酸【（4s,5s）-5-（乙氧基羰基）-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-羧酸】即化合物2（1.31g，6.0mmol）、1-羟基苯并三唑（0.81g，6.0mmol）、二甲基氨基吡啶（0.73g，6.0mmol)、n,n-二环己基碳二酰亚胺（1.48g，7.2mmol）加入干燥的二氯甲烷（25ml）中，室温搅拌30min。再加入2-甲氧基-4-硝基苯胺即化合物3a（1.21g，7.2mmol），室温反应8h。反应完毕后，分别用饱和碳酸氢钠溶液（20ml×3）、5%稀盐酸（20ml×3）、水（20ml×3）洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得粗产物1.21g，将粗产物（1.21g，3.3mmol）溶于5ml1,4-二氧六环中，加5ml水，然后加入1n氢氧化钠溶液（5ml，4.9mmol），室温搅拌反应。待反应完毕后，用5%稀盐酸溶液调ph至2-3，二氯甲烷萃取（10ml×3），合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，柱层析得到化合物4a（0.70g），黄色固体，收率64%；按相似的合成方法，可得化合物4b-4r。
实施例2、（2s,3s）-2,3-二羟基-n-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1基）-4-氧代丁酰胺（1a）的制备
在25ml烧瓶中分别加入化合物4a（0.37g，1.1mmol）、三乙胺（0.47g，4.6mmol）、二氯甲烷10ml，用注射器量取50%含量丙基磷酸三环酸酐的乙酸乙酯溶液（5.4ml，9.1mmol）并加入到反应液，搅拌10min。将化合物5（0.2g，0.91mmol）加入反应瓶，室温搅拌30min后45℃油浴回流反应。tlc监测反应大部分完成后，冷却至室温，加入10ml饱和碳酸氢钠溶液，搅拌10min后用二氯甲烷萃取（10ml×3），合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干低沸点溶剂得粗产物白色固体（0.26g）。将粗产物（0.26g，0.48mmol）加入1n稀盐酸溶液（3.5ml，3.5mmol）和10ml甲醇的混合溶剂中，50℃油浴搅拌反应。待反应完全后冷却至室温，加10ml水，用5%氢氧化钠溶液调ph至7-8，二氯甲烷萃取（10ml×3），合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂，柱层析得白色固体（0.12g）；收率67%；1hnmr(600mhz,dmso)δ9.57(s,1h),8.55(d,j=8.6hz,1h),7.96(d,j=8.5hz,1h),7.86(s,1h),7.72(s,1h),7.60(s,1h),6.55(s,1h),5.12(d,j=75.0hz,1h),4.75(d,j=10.4hz,1h),4.36(d,j=4.8hz,1h),4.03(s,3h),3.87(s,3h),3.64(d,j=77.8hz,4h),2.82–2.74(m,2h),1.66(d,j=43.0hz,4h).13cnmr(151mhz,dmso)δ171.64,169.64,161.51,148.13,143.20,142.19,133.63,129.07,118.57,117.81,117.78,106.43,73.26,70.84,57.30,54.83,41.03,39.54,38.62,37.04,36.92,29.63.hrms(esi):calcdforc22h26n6o8[m+na]+,525.1704,found,525.1702。
按相同合成步骤，可得化合物1b-1r。
（2s,3s）-n-（4-溴苯基）-2,3-二羟基-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4-5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1基-4-氧代丁酰胺（1b）
白色固体（0.10g）；收率64%；1hnmr(600mhz,meod)δ7.63(d,j=7.4hz,2h),7.49(s,1h),7.23(d,j=7.3hz,2h),5.07(s,1h),4.45(s,1h),3.87(s,3h),3.77(m,4h),2.96(s,2h),1.81(d,j=64.6hz,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ172.34,171.45,166.05,140.53,139.10,131.98,131.31,127.94,122.76,121.21,120.84,119.06,72.84,69.89,48.44,41.75,38.92,38.84,37.01,35.79,28.73.lc-ms(esi):m/z507[m+h]+。
（2s,3s）-2,3-二羟基-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-基）-4-氧代-n-（对甲苯基）丁酰胺(1c)
白色固体（0.12g）；收率63%；1hnmr(600mhz,meod)δ7.54(s,2h),7.49(s,1h),7.25(s,2h),5.04(s,1h),4.56(s,1h),3.95(s,3h),3.67(d,j=37.0hz,4h),2.84(s,2h),2.61(s,3h),1.75(d,j=32.6hz,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ170.21,169.06,162.34,140.12,138.43,133.94,129.04,125.04,124.41,119.86,119.52,118.11,70.06,68.23,48.31,42.01,41.94,41.43,36.23,35.21,26.92.lc-ms(esi):m/z443[m+h]+。
（2s,3s）-2,3-二羟基-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-基）-n-（2-硝基苯基）-4-氧代丁酰胺(1d)
黄色固体（0.10g）；收率56%；1hnmr(600mhz,meod)8.76(d,j=7.3hz,1h),8.31(d,j=8.3hz,1h),7.77(t,j=7.9hz,1h),7.46(s,1h),7.29(t,j=8.2hz,1h),5.03(s,1h),4.49(s,1h),3.97(s,3h),3.81(d,j=87.4hz,4h),2.87(s,2h),1.99(d,j=21.7hz,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ172.34,171.95,145.92,144.67,138.59,124.99,124.64,119.58,116.94,71.86,69.86,49.05,41.13,39.90,39.11,32.34,28.82.lc-ms(esi):m/z474[m+h]+。
（2s,3s）-2,3-二羟基-n-（4-羟基苯基）-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4-，5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1基）-4-氧代丁酰胺(1e)
白色固体（0.10g）；收率53%；1hnmr(600mhz,meod)δ8.01(s,1h),7.44(s,1h),6.88(t,j=7.4hz,1h),6.78(d,j=7.8hz,1h),6.72(t,j=7.5hz,1h),5.07(s,1h),4.41(s,1h),3.85(s,3h),3.67(dd,j=31.8,17.6hz,4h),2.83(d,j=17.8hz,2h),1.76(m,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ170.80,170.28,162.62,141.29,129.22,125.05,120.69,119.28,118.88,114.70,72.82,69.92,48.18,41.70,38.59,38.30,36.27,35.64,29.50,29.21.lc-ms(esi):m/z445[m+h]+。
（2s,3s）-2,3-二羟基-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-基）-4-氧代-n-苯基丁酰胺(1f)
白色固体（0.12g）；收率57%；1hnmr(600mhz,meod)δ7.79(d,j=7.9hz,2h),7.43(s,1h),7.32(t,j=7.8hz,2h),7.19(t,j=7.4hz,1h),5.05(t,j=5.4hz,1h),4.44(m,1h),3.96(s,3h),3.88-3.61(m,4h),2.82(d,j=10.3hz,2h),1.94-1.72(m,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ169.50,168.23,162.56,141.89,138.32,129.12,129.06,124.37,121.11,118.98,72.26,70.44,57.97,41.68,38.74,38.43,36.21,35.71,28.89.lc-ms(esi):m/z429[m+h]+。
（2s,3s）-2,3-二羟基-n-（6-甲氧基嘧啶-4-基）-4-（2'-甲基-7'-氧代-2'，4'，6'，7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1基）-4-氧代丁酰胺(1g)
淡黄色固体（0.09g）；收率48%；1hnmr(600mhz,meod)9.06(s,1h),8.30(s,1h),7.75(s,1h),5.14(s,1h),4.55(s,1h),3.99(s,3h),3.96(s,3h),3.81(s,4h),2.98(d,j=24.3hz,2h),1.88(d,j=54.2hz,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ171.86,170.75,166.32,163.83,143.97,143.41,130.49,120.11,119.30,99.59,72.31,69.73,55.39,48.52,41.79,38.91,38.75,36.33,35.64,29.38.lc-ms(esi):m/z461[m+h]+。
（2s,3s）-n-（2-氯苯基）-2,3-二羟基-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1基）-4-氧代丁酰胺(1h)
白色固体（0.15g）；收率64%；1hnmr(600mhz,meod)δ7.90(s,1h),7.78(m,1h),7.60(m,1h),7.48(s,1h),7.22(s,j=6.2hz,1h),5.29(s,1h),4.90(s,1h),3.97(s,3h),3.92(m,4h),2.91(s,2h),1.73(d,j=3.1hz,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ172.56,171.85,161.94,141.61,138.97,131.01,128.46,125.95,124.47,121.04,120.17,119.34,118.17,72.29,69.64,48.44,40.89,40.02,39.65,31.65,30.26,29.61.lc-ms(esi):m/z463[m+h]+。
（2s,3s）-2,3-二羟基-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-基）-n-（4-硝基苯基）-4-氧代丁酰胺(1i)
褐色固体（0.13g）；收率59%；1hnmr(600mhz,meod)δ8.66(s,1h),8.26(d,j=9.0hz,2h),7.79(m,2h),5.00(d,j=5.5hz,1h),4.47(s,1h),3.95(s,3h),3.72(m,4h),2.96(s,2h),2.01(m,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ172.26,171.85,144.32,143.72,138.67,125.11,124.34,118.98,116.34,72.22,70.02,49.45,40.23,39.78,38.91,32.45,29.12.lc-ms(esi):m/z474[m+h]+。
（2s,3s）-2,3-二羟基-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-基）-4-氧代-n-（4-（三氟甲基）苯基）丁酰胺(1j)
褐色固体（0.09g）；收率53%；1hnmr(600mhz,meod)δ8.22(s,2h),7.99(s,2h),7.67(s,1h),5.25(d,j=53.7hz,1h),4.59(d,j=51.0hz,1h),3.98(s,3h),3.75(m,4h),3.05-2.86(m,2h),2.08-1.66(m,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ170.74,170.35,163.25,141.42,138.62,134.01,131.02,129.83,124.46,120.37,119.16,118.75,69.95,69.73,48.52,41.77,38.77,38.62,36.32,35.59,29.30.lc-ms(esi):m/z497[m+h]+。
（2s,3s）-2,3-二羟基-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-基）-n-（3-硝基苯基）-4-氧代丁酰胺(1k)
褐色白色固体（0.12g）；收率64%；1hnmr(600mhz,meod)δ8.61(s,1h),7.90(s,1h),7.88(s,1h),7.54(s,1h),7.47(t,j=7.7hz,1h),5.03(s,1h),4.46(s,1h),4.11(m,1h),3.87(s,3h),3.78-3.61(m,4h),2.85(s,2h),1.75(d,j=40.7hz,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ171.38,170.41,168.26,148.58,138.83,129.58,129.29,119.10,118.97,118.78,118.54,114.93,72.56,69.90,48.19,38.37,36.38,35.66,29.56,29.03,23.59.lc-ms(esi):m/z474[m+h]+。
（2s,3s）-n-（3-溴苯基）-2,3-二羟基-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1基）-4-氧代丁酰胺(1l)
白色固体（0.08g）；收率59%；1hnmr(600mhz,meod)δ7.84(s,1h),7.67-7.60(m,1h),7.53(s,1h),7.31(s,1h),7.14(d,j=6.4hz,1h),5.20(d,j=58.4hz,1h),4.61-4.51(m,1h),3.98(s,3h),3.84-3.68(m,4h),2.97(s,2h),1.88(d,j=57.9hz,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ172.12,171.54,162.65,141.34,139.58,130.38,128.67,126.29,124.97,120.98,120.54,119.73,117.87,72.12,69.43,48.20,40.27,39.98,39.61,30.56,31.25,29.69.lc-ms(esi):m/z507[m+h]+。
（2s,3s）-2,3-二羟基-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-基）-4-氧代-n-（间甲苯基）丁酰胺(1m)
白色固体（0.08g）；收率59%；1hnmr(600mhz,meod)δ7.63(s,1h),7.49(s,1h),7.37(s,1h),7.18(s,1h),6.98(s,1h),5.09(s,1h),4.44(s,1h),3.97(s,3h),3.59(d,j=27.0hz,4h),2.92(s,2h),2.43(s,3h),1.64(d,j=37.6hz,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ170.56,168.66,161.94,139.04,138.71,134.08,129.77,124.44,124.09,120.36,120.07,118.31,69.86,67.49,48.20,41.68,41.58,41.20,36.37,35.78,25.10.lc-ms(esi):m/z443[m+h]+。
（2s,3s）-2,3-二羟基-n-（2-甲氧基苯基）-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1基）-4-氧代丁酰胺(1n)
白色固体（0.09g）；收率56%；1hnmr(600mhz,meod)δ7.85(d,j=7.9hz,1h),7.47(s,1h),7.17(t,j=7.8hz,1h),7.10(t,j=7.4hz,1h),7.07(t,j=7.6hz,1h),5.07(t,j=5.4hz,1h),4.84(m,1h),3.96(s,3h),3.88-3.61(m,4h),2.82(d,j=10.3hz,2h),1.94-1.72(m,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ169.50,168.23,162.56,141.89,138.32,129.12,129.06,124.37,121.11,118.98,72.26,70.44,57.97,41.68,38.74,38.43,36.21,35.71,28.89.lc-ms(esi):m/z459[m+h]+。
（2s,3s）-2,3-二羟基-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-基）-4-氧代-n-（邻甲苯基）丁酰胺(1o)
白色固体（0.10g）；收率57%；1hnmr(600mhz,meod)δ7.48(s,1h),7.29(t,j=7.6hz,1h),7.27(t,j=7.8hz,1h),7.18(t,j=7.4hz,1h),7.09(t,j=7.4hz,1h),5.05(s,1h),4.49(s,1h),3.87(s,3h),3.59(m,4h),2.96(s,2h),2.24(s,3h),1.64(d,j=48.6hz,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ171.80,170.76,162.02,135.84,131.74,130.88,129.64,125.98,124.87,123.98,120.07,118.09,72.96,71.78,48.67,40.68,40.08,39.86,36.34,35.39,28.53,18.34.lc-ms(esi):m/z443[m+h]+。
（2s,3s）-n-（2-溴苯基）-2,3-二羟基-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1基）-4-氧代丁酰胺(1p)
白色固体（0.10g）；收率48%；1hnmr(600mhz,meod)δ7.87(s,1h),7.74(m,1h),7.53(m,1h),7.47(s,1h),7.21(s,j=6.2hz,1h),5.24(s,1h),4.84(s,1h),3.96(s,3h),3.84(m,4h),2.87(s,2h),1.68(d,j=46.9hz,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ172.23,171.05,162.34,141.22,139.23,130.87,128.41,126.26,124.37,120.85,120.47,119.58,117.87,72.09,69.29,48.36,40.87,39.82,39.48,31.65,30.12,29.23.lc-ms(esi):m/z507[m+h]+。
（2s,s）-n-（4-氯苯基）-2,3-二羟基-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1基）-4-氧代丁酰胺(1q)
白色固体（0.10g）；收率58%；1hnmr(600mhz,meod)δ7.56(d,j=6.4hz,2h),7.46(s,1h),7.23(d,j=7.3hz,2h),5.03(s,1h),4.40(s,1h),3.85(s,3h),3.77-3.60(m,4h),2.84(s,2h),1.75(d,j=55.6hz,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ170.75,170.52,162.65,141.37,138.10,131.53,131.02,128.44,122.48,121.89,121.67,118.96,72.44,69.79,48.18,41.51,38.57,38.30,36.27,35.61,29.10.lc-ms(esi):m/z463[m+h]+。
（2s,3s）-n-（3-氯苯基）-2,3-二羟基-4-（2'-甲基-7'-氧代-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1基）-4-氧代丁酰胺(1r)
白色固体（0.08g）；收率54%；1hnmr(600mhz,meod)δ7.84(s,1h),7.66-7.56(m,1h),7.53(s,1h),7.31(s,1h),7.14(d,j=6.4hz,1h),5.20(d,j=58.4hz,1h),4.62-4.51(m,1h),3.98(s,3h),3.73(dd,j=53.2,20.0hz,4h),2.97(s,2h),1.88(d,j=57.9hz,4h).13cnmr(151mhz,meod)δ171.89,169.41,163.20,141.89,141.59,136.12,130.95,128.03,125.47,122.43,119.79,116.34,71.32,69.80,48.51,41.54,38.69,38.51,36.23,35.67,29.58.lc-ms(esi):m/z463[m+h]+。
实施例3、二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'（6'h）-酮d-酒石酸衍生物类的几丁质合成酶活性抑制实验
几丁质合成酶来源于啤酒酵母细胞膜，酶与底物在微孔板上一起孵化反应，产生的几丁质与板上包被的wga结合在一起而被固定，然后加入wga-hrp，wga-hrp可与固定在板上的几丁质结合，将多余的试剂用蒸馏水洗掉，然后使用tmb底物溶液检测hrp的活性，使用2m的硫酸终止反应后在450nm处检测其od，计算出化合物的ic50值。化合物1a-r都进行了几丁质合成酶抑制活性初筛，初筛的最高药物浓度为300μg/ml，抑制率（ip,inhibitionpercentage）为该最高药物浓度对几丁质合成酶的抑制率，对几丁质合成酶抑制活性较好的化合物进一步测试其ic50值，初筛结果和ic50值如表1所示。
实施例4、二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'（6'h）-酮d-酒石酸衍生物类的体外抗微生物活性实验
采用符合美国国家委员会制定的临床实验标准（clinicalandlaboratorystandardsinstitute,clsi）的96孔微量稀释法，检查实施例2制得的二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'（6'h）-酮d-酒石酸衍生物类对革兰氏阳性菌（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsan315）、金黄色葡萄球菌（atcc25923）、枯草杆菌（atcc6633））、革兰氏阴性菌（大肠杆菌（jm109）、铜绿假单胞菌（atcc9027）、变形杆菌（atcc8427））和真菌（白色念珠菌（atcc76615）、烟曲霉菌（gimcc3.19）、白色念珠菌（atcc90023）、黄曲霉菌（atcc16870）、新型隐球菌（atcc32719））的最低抑制浓度（mic），将待测化合物用少量二甲亚砜溶解，用灭菌水制成溶液备用，将96孔板，西林瓶，枪头等物品高压灭菌，用移液枪移取稀释好的菌液溶液100ul到96孔板中，用链霉素，左氧氟沙星；氟康唑和多抗霉素b作为参比对照。细菌，真菌在37℃培养24h，观察现象。结果见表2、表3。