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一种重组蛋白复性缓冲液及其配制方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组蛋白复性缓冲液及其配制方法和应用，所述缓冲液由基础液和5‰的β-巯基乙醇、1%的吐温-20、10mM的β-环糊精、1M的L-半胱氨酸以及4M的尿素组成；其配制方法为先向基础液中加入4M的尿素；后加入体积比为5‰的β-巯基乙醇、1%的吐温-20以及10mM的β-环糊精和1M的L-半胱氨酸，即形成重组蛋白复性缓冲液；本发明所述缓冲液应用于初始蛋白浓度高于1mg/mL的重组蛋白复性，操作简单，成本低，方便工业化生产，复性后蛋白体积增大较少，蛋白浓度稀释较小，并且复性率较高。
【专利说明】一种重组蛋白复性缓冲液及其配制方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物化学领域，特别是一种重组蛋白复性缓冲液及其配制方法和应用。
【背景技术】[0002]由于重组蛋白在细菌体内表达导致肽链的不完全修饰、错误折叠和聚集，一般以包涵体的形式存在。破碎细菌获得纯净的包涵体，经变性剂(6M盐酸胍或8M尿素)溶解后，必须经过复性使蛋白正确折叠，提高溶解度并且恢复生物活性后才能达到临床应用的水平。如果蛋白不能很好地复性，则直接表现为溶解度下降，蛋白析出沉淀，从而造成蛋白的大量损失。由于技术水平的限制，蛋白质的复性和纯化是限制生物制药领域快速发展的瓶颈。目前常用的包涵体蛋白复性的技术主要有:透析复性、稀释复性、人工分子伴侣、柱色谱复性以及反胶团溶解复性等。上述各复性方法多少存在着种种问题，例如:透析复性将变性蛋白放入透析袋中，通过缓慢联系的降低变性剂的浓度实现蛋白复性，虽然操作简单但是耗时长，处理体积小，无法大规模工业化应用。稀释复性是通过将变性蛋白溶液用水或复性缓冲液稀释，实现变性剂浓度的缓慢下降，达到蛋白复性的目的，但是在目前没有通用的复性缓冲液，而且据目前文献报道，通过该方法复性时，需将蛋白浓度控制在较低的水平，不适用于高浓度的蛋白，目前的稀释复性方法中一般将初始蛋白浓度控制在10-100Pg/mL，甚至更低。因此，用传统的复性方法会大量稀释蛋白，最终造成体积的快速增加，导致后期蛋白浓缩困难，也不适用于工业化的生产。人工分子伴侣的复性常用Hsp家族蛋白和GroES /GroEL等，人工分子伴侣能够显著提高蛋白复性率，但同时也会显著提高生产成本。柱色谱复性以及反胶团溶解复性需要材料和设备特殊、成本较高、不适用于制药工业的大量制备等，而且操作过程相对繁琐。总之，目前尚未有适用于初始蛋白浓度高于lmg/mL的复性报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供针对蛋白复性技术的不足，提供一种高浓度重组蛋白快速复性的缓冲液。本发明的目的是这样实现的:
一种重组蛋白复性缓冲液，其特征在于，所述缓冲液由基础液和5%。(6-巯基乙醇、1%的吐温-20、IOmM的P -环糊精、IM的L-半胱氨酸以及4M的尿素组成；所述基础液包括20mM 的 Tris-HCl、200mM 的 NaCl 和无菌水。
[0004]本发明中，所述的缓冲液的配制方法:
A)基础液的配制:在无菌水中加入20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl，调节pH为8.0 ；
B)向步骤A所述基础液中加入4M的尿素；
C)向步骤B溶液中加入体积比为5%。的P-巯基乙醇、1%的吐温-20以及IOmM的^ -环糊精和IM的L-半胱氨酸，形成重组蛋白复性缓冲液。
[0005]一种如权利要求1所述的缓冲液在初始蛋白浓度高于lmg/mL的重组蛋白复性中的应用。
[0006]本发明的优点在于:操作简单，成本低，所需的仪器药品均为实验室常规用品，方便工业化生产，而且可以对浓度高于lmg/mL的蛋白进行复性。复性后蛋白体积增大较少，蛋白浓度稀释较小，并且复性率较高；复性后的蛋白可以经过等电点沉淀后，去除残留的药物，同时可以除去一部分杂蛋白，等电点脱盐和初步纯化的蛋白为清澈透明液体，方便后续纯化操作。
【具体实施方式】
[0007]实施例1重组蛋白复性缓冲液配置
A)基础液的配制:在无菌水中加入20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl，调节pH为
8.0 ；
B)向步骤A所述基础液中加入4M的尿素；
C)向步骤B溶液中加入体积比为5%。的P-巯基乙醇、1%的吐温-20以及IOmM的^ -环糊精和IM的L-半胱氨酸，形成重组蛋白复性缓冲液。
[0008]实施例2初始蛋白溶液的配制 基础液的配制:
在无菌水中加入20mM的Tris-HCl、200mM的 NaCl，调节pH为8.0 ;
向基础液中加入8M的尿素，搅拌均匀，配制成混合溶液，将初步纯化的重组猪抑制素a亚基蛋白包涵体1Og溶解在500mL所述混合溶液中，得到初始浓度为20mg/mL的重组猪抑制素a亚基蛋白包涵体溶液(以下简称初始蛋白溶液)。
[0009]本实施例涉及的初步纯化的重组猪抑制素a亚基蛋白包涵体是 申请人:依据中国专利CN201010618516.4公开的方法获得。
[0010]实施例3重组蛋白的复性 基础液的配制:
在无菌水中加入20mM的Tris-HCl、200mM的 NaCl，调节pH为8.0 ;
(1)将实施例2获得的浓度为20mg/mL的初始蛋白溶液在4°C下慢速加入实施例1获得的重组蛋白复性缓冲液(以下简称缓冲液)中，同时缓慢搅拌，所述初始蛋白溶液与缓冲液的体积比为1:1 ;搅拌均匀后在4°C环境下，12000rpm离心lOmin，收集蛋白上清液；
(2)将基础液慢速加入缓冲液中，形成稀释的复性缓冲液，其中尿素的终浓度为1M，所述基础液与缓冲液的体积比为3:1 ;将步骤(1)获得的蛋白上清液在4°C环境下缓慢加入所述稀释的缓冲液中，同时缓慢搅拌，所述的蛋白上清液与稀释的缓冲液的体积比为1:1 ;搅拌均匀后，在4°C环境下，以12000rpm离心lOmin，收集蛋白上清液；
(3)将步骤(2)获得的蛋白上清液慢速加入等体积的基础液中，同时缓慢搅拌，搅拌均匀后，在4°C以12000rpm离心lOmin，收集蛋白上清液，即为复性的重组猪抑制素a亚基蛋白溶液，完成重组猪抑制素a亚基蛋白的复性。
[0011]经OD280法检测，复性的重组猪抑制素a亚基蛋白溶液中蛋白终浓度约为2.2 mg/mL。蛋白的复性，直接表现在蛋白的溶解度上，即:复性好的蛋白呈溶解状态，未复性的蛋白则沉淀析出，经过离心去除。根据复性前和复性后呈溶解状态的蛋白的含量，复性蛋白占总蛋白的百分比，计算出蛋白的复性率。[0012]复性率计算公式如下:
,
【权利要求】
1.一种重组蛋白复性缓冲液，其特征在于，所述缓冲液由基础液和5%。的(6-巯基乙醇、1%的吐温-20、IOmM的P -环糊精、IM的L-半胱氨酸以及4M的尿素组成；所述基础液包括20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl和无菌水。
2.一种如权利要求1所述的缓冲液的配制方法，其特征在于: A)基础液的配制:在无菌水中加入20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl，调节pH为8.0 ； B)向步骤A所述基础液中加入4M的尿素； C)向步骤B溶液中加入体积比为5%。的P-巯基乙醇、1%的吐温-20以及IOmM的^ -环糊精和IM的L-半胱氨酸，形成重组蛋白复性缓冲液。
3.—种如权利要求1所述的缓冲液在初始蛋白浓度高于lmg/mL的重组蛋白复性中的应用。`